SILAC蛋白定量试剂盒及试剂

对于差异蛋白表达进行定量分析。

在细胞培养中使用氨基酸进行稳定的同位素标记（SILAC）是鉴定和定量复杂蛋白样品中相关差异的变化的一种有效的方法。SILAC方法通过体内代谢将“重的”13C-或15N标记的氨基酸整合到蛋白中然后进行质谱（MS）分析以便加快对蛋白的测定、鉴定、定量和理解。

应用：

•  可以使用专门针对干细胞的试剂盒对干细胞分化中的蛋白进行鉴定。

•  可以对不同细胞处理后的蛋白丰度的相关变化进行定量的分析。

•  可以对没有抗体的蛋白进行定量分析。

•  正常细胞vs.疾病细胞的蛋白表达谱的绘制。

•  可以在一个实验中对成千上万的蛋白进行鉴定和定量。

产品特点：

标记物能够100%的整合到活细胞的蛋白中。

• 可重复 – 降低由于样品制备不同而造成的实验内差异。

• 灵活 – 培养基中缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸两种氨基酸，因此可以通过两种氨基酸的同位素标记更加完全的覆盖整个蛋白质组。

• 通用 – 可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的哺乳动物细胞中表达的蛋白进行标记，这些细胞包括HeLa，293T，COS7，U2OS，A549，A431，HepG2，NIH 3T3，Jurkat及其它。

• 兼容– 可以通过分化培养基测定人间质干细胞或小鼠胚胎干细胞中调节发育的重要蛋白。

        SILAC需要在含有轻或重的必需氨基酸的培养基中培养哺乳动物细胞；例如，分别含有12C6及13C6 L-赖氨酸。常规的实验包括在含有轻氨基酸（对照）的培养基中培养一批细胞，同时在含有重氨基酸（实验组）的培养基中培养相同的另一批细胞。轻、重氨基酸通过自然的细胞内蛋白合成的过程整合到蛋白中。在对一个样品进行化学处理或者遗传操作使其蛋白质组发生变化之后，将从两种细胞中得到的蛋白等量的混合在一起，然后利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并利用胰酶进行消化然后进行MS分析。由于标记有重和轻氨基酸的多肽在化学性质上是完全相同的，因此这两种多肽在反相柱洗脱时是同时洗脱的，因此能够在MS分析中同时检测到两种多肽。然后就可以利用来自于每种蛋白的同位素标记的多肽的相

         对峰强度来确定处理后的样品的蛋白丰度的变化。（见下图）我们提供几种不同的Thermo Scientific Pierce SILAC试剂盒，还提供能够支持不同类型的哺乳动物细胞系生长的培养基，这些细胞系甚至包括人间质干细胞和小鼠胚胎干细胞。每个试剂盒都包括同位素标记细胞所需的所有试剂，这些试剂包括培养基、重和轻氨基酸对以及透析过的血清。几种同位素标记的赖氨酸和精氨酸都是单独提供的，因此可以进行多重实验和分析。当与Thermo Scientific蛋白/多肽样品富集产品结合使用时，可以使用Pierce SILAC蛋白定量试剂盒对低丰度蛋白进行MS分析，这些低丰度蛋白包括细胞表面蛋白、细胞器特异性蛋白以及磷酸化蛋白或糖蛋白这些经过翻译后修饰的蛋白。

SILAC实验流程示意图。

利用含有0.1毫克/毫升的重13C6 L-赖氨酸-2HCl或轻L-赖氨酸-HCl，并且含有10%透析过的FBS的SILAC DMEM培养基（产品货号：89983）培养A549细胞，培养六代（10天）。在完全标记后，利用5 μM喜树碱（Sigma，St. Louis，产品货号C9911）处理13C6 L-赖氨酸标记的细胞24小时。利用Thermo ScientificM-PER哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂（产品货号：78501）裂解来自每种样品（轻和重）的细胞。将样品按照使用Thermo Scientific BCA蛋白定量试剂（产品货号：23225）测定的蛋白浓度进行标准化，然后从每种样品中取50毫克并混匀，此后利用4-20%的梯度十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析样品。利用Thermo Scientific GelCode蓝色染色试剂（产品货号：24592）对凝胶进行染色，利用Thermo Scientific 胶内胰酶消化试剂盒（产品货号：89871）对蛋白进行消化和烷基化，最后利用LTQ Orbitrap杂交质谱进行分析。

实验示例

        使用Thermo Scientific SILAC定量试剂盒，利用13C6L赖氨酸标记培养在DMEM培养基中的A549细胞，标记效率>98%。裂解喜树碱处理过的重同位素标记的细胞，将其裂解液与对照组的裂解液等量混合，然后利用SDS-PAGE对混合液进行分离并利用胰酶进行消化，最后进行MS分析。利用Thermo Scientific LTQ Orbitrap质谱通过MS/MS测序成功的鉴定出了超过350种蛋白。然后利用Thermo Scientific Bioworks软件包对鉴定出的多肽进行定量，得到了与蛋白丰度相关变化对应的SILAC比例。

        鉴定出来的蛋白在喜树碱处理之后都没有蛋白丰度的变化；然而，重同位素标记的细胞中定量出的蛋白中20%的蛋白的量比对照组高（SILAC比例）1.5倍。喜树碱处理后被上调的蛋白中有一种蛋白是增殖细胞核抗原（PCNA），该蛋白会参与DNA修复（见下图）。为了验证SILAC数据，通过蛋白免疫印迹对蛋白分别进行定量（见下图）。PCNA蛋白水平增加了1.9倍；然而3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）并没有显著的变化。由蛋白免疫印记确定的蛋白丰度的变化与SILAC的数据完全吻合。

使用SILAC所得的MS图谱。通过MS来分析PCNA中含有轻和重（13C6）L赖氨酸的多肽（AEDNADTLALVFEAPNQEK）。含有13C6的L赖氨酸的重多肽的质谱的分子量增加了6Da并且由于多肽的离子化为+2所以与轻多肽相比产生了质荷比（m/z）为3的偏移。

通过蛋白免疫印迹比较喜树碱处理后A549细胞中蛋白水平的变化。通过4-20%的梯度SDS-PAGE分析轻（L）和重（H）样品各10毫克，并利用特异性的抗体进行蛋白免疫印迹。

参考文献

Bomgarden,R.,et al.（2008）.Previews.11（2）:24-25.

Everly,P.A.,et al.（2004）.Mol & Cell Proteomics.3.7:729-735.

Levine, A.J.（1997）.Cell.88:323-331.

Mann,M.（2006）.Nature Reviews.7:952-959.

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